Projekt finansowany ze środków budżetu państwa, przyznanych przez Ministra Edukacji i Nauki w ramach Programu „Studenckie koła naukowe tworzą innowacje” (nr SKN/SP/570395/2023).

Okres realizacji: 28.04.2023 – 28.04.2024

Budżet projektu: 69 830 zł

Koordynatorzy naukowi: dr Ilona Sadok, dr hab. Rafał Łopucki

Przedmiot projektu:

Projekt dotyczy aktualnego, globalnego problemu rosnącej lekooporności drobnoustrojów i odpowiada na potrzebę monitorowania i badania tego zjawiska oraz minimalizowania jego negatywnych konsekwencji. Zaproponowano lokalnie działania mające na celu zwiększenie bezpieczeństwa mikrobiologicznego dzieci na placach zabaw na terenach miejskich poprzez stworzenie platformy wymiany informacji między światem naukowym a społeczeństwem.

Podczas realizacji projektu będzie możliwość praktycznego wykorzystania wielu technik laboratoryjnych stosowanych w biotechnologii i medycynie oraz pracy na zaawansowanej aparaturze naukowo-badawczej.

Cele projektu:

- Podniesienie świadomości społecznej, świadomości rodziców i przedsiębiorców na temat bezpieczeństwa mikrobiologicznego obiektów przeznaczanych dla najmłodszych.

 - Stworzenie korzystnych warunków dla nawiązywania bliższej współpracy pomiędzy nauką a społeczeństwem poprzez utworzenie nowoczesnej platformy wymiany informacji (interaktywna mapa zagrożeń).

 - Zwiększenie bezpieczeństwa mikrobiologicznego na placach zabaw na terenach miejskich.

 - Pobudzanie pasji naukowych wśród członków Koła Naukowego Biotechnologii KUL.

- Kształtowanie umiejętności wystąpień publicznych  i nabywanie umiejętności pracy w zespole.

 - Umożliwienie prowadzenia badań wykraczających poza standardowy zakres programu studiów.

 - Wykształcenie umiejętności prawidłowego planowania eksperymentów, terminowego wykonania powierzonych zadań oraz opracowywania wyników badań.

- Integracja studentów Koła z pracownikami naukowymi w ramach realizacji działań przewidzianych w projekcie oraz zdobycie nowej wiedzy i kompetencji.

 - Opracowanie protokołów i metodologii badawczej, która będzie mogła być wykorzystana w kolejnych projektach powiązanych z poruszaną tematyką.

- Stworzenie banku izolatów bakterii.

 - Promocja wyników badań i współpracy międzyuczelnianej, upowszechnienie osiągnięć naukowych członków Koła.

 - Zwiększenie potencjału Uczelni w zakresie wpływu prowadzonych badań na społeczeństwo.

- Upowszechnienie działalności Koła Naukowego Biotechnologii KUL.

PRZEBIEG REALIZACJI PROJEKTU:

Etap 1. Typowanie obiektów

W maju i w czerwcu 2023 r. odbyliśmy kilka spotkań mających na celu wytypowanie placów zabaw, z których pobrany zostanie materiał do badań. Wśród propozycji znalazły się głównie obiekty popularnie odwiedzane przez najmłodszych z różnych regionów Lublina. Pogrupowaliśmy je biorąc pod uwagę charakter ich bezpośredniego sąsiedztwa. Zdecydowaliśmy, że badane place zabaw podzielimy na dwie grupy. Pierwszą grupę będą stanowiły place zlokalizowane w otoczeniu zieleni miejskiej (nazwaliśmy je „place przyrodnicze”, w skrócie PP). Drugą grupę będą natomiast stanowiły place zlokalizowane raczej wśród zabudowy miejskiej, z niewielką ilością elementów przyrodniczych takich jak drzewa i krzewy (nadaliśmy im nazwę „place miejskie” PM). Ostatecznie do badań wyselekcjonowaliśmy 33 place. Pracowaliśmy w grupie 5-osobowej pod nadzorem merytorycznym naszych koordynatorów naukowych z Instytutu Nauk Biologicznych KUL – dr hab. Rafała Łopuckiego i dr Ilony Sadok.

Lista wytypowanych do badań placów zabaw w Lublinie

Etap 2. Pobór materiału badawczego

W drugiej połowie czerwca 2023 r. wyruszyliśmy wyposażeni w sterylne wymazówki pojemniki na place zabaw. Materiał pobierany był zgodnie z wcześniej opracowanym protokołem. Naszym celem było pobranie materiału z najpopularniejszych atrakcji danego obiektu. Interesowały nas powierzchnie tj. drewno, plastik, metal, sznury naturalne i sztuczne, guma oraz podłoża – gleba, piasek, żwirek, guma.

Każda próbka została zakodowana i opisana ściśle z wypracowanymi  wcześniej zasadami wraz z koordynatorami naukowymi. W pobór próbek zaangażowało się 6 członków Koła.

Podczas pobierania próbek spotykaliśmy się z dużym zainteresowaniem naszymi działaniami - o to co robimy pytały nas zarówno dzieci przebywające na placach zabaw, jak i ich opiekunowie. W efekcie odbyliśmy dziesiątki rozmów o naszym projekcie z różnorodnymi użytkownikami placów zabaw. Tłumaczyliśmy zarówno założenia projektu, jak i to, że jego wyniki będą wkrótce udostępnione na specjalnej stronie internetowej. Co ważne, nasze działania spotykały się zawsze z bardzo pozytywnym odbiorem przez mieszkańców Lublina. Te rozmowy utwierdzały nas w przekonaniu, że robimy coś interesującego i pożytecznego.

Odwidzieliśmy m.in.:

Etap 3. Namnożenie bakterii i zabezpieczenie materiału

Pobrane wymazy z różnych elementów placów zabaw oraz próbki podłoży trafiały do laboratorium w Katedrze Biomedycyny i Badań Środowiskowych, gdzie pod czujnym okiem dr Marcina Skowronka namnażaliśmy bakterie w bulionie kazeinowo-sojowym.

Prace laboratoryjne przeprowadzał specjalnie powołany zespół składający się z 3 członków Koła. Po namnożeniu bakterii zabezpieczaliśmy je poprzez dodatek glicerolu. Podczas realizacji tego zadania projektu mieliśmy okazję utrwalić wiedzę zdobytą w trakcie studiów na kierunku Biotechnologia.

Etap 4. Wykonanie posiewów bakteryjnych i izolacja pojedynczych kolonii

Istotnym etapem realizacji projektu było uzyskanie czystych izolatów kolonii bakterii. Wcześniej zabezpieczone próbki ożywiano i posiewano na chromogennych podłożach m.in. do szybkiego wykrywania Escherichia coli, Enterococcus faecium i Enterococcus faecalis z nabytą opornością na wankomycynę, Staphylococcus ureus, Clostridium difficile, Pseudomonas aeruginosa oraz Salmonelli. Po odpowiednim czasie inkubacji, wyizolowano pojedyncze, różno zabarwione kolonie bakterii i zabezpieczono do identyfikacji mikroorganizmów techniką MALDI-TOF.

Posiewy mikrobiologiczne prowadzone są w Katedrze Biomedycyny i Badań Środowiskowych przy współpracy z dr Marcinem Skowronkiem.

Etap 5. Identyfikacja bakterii techniką MALDI-TOF i bankowanie izolatów bakterii

Spektrometr mas typu MALDI-TOF (Matrix-Assisted Laser Desorption/Ionization) pozwala na zebranie widma unikatowego profilu białkowego badanego mikroorganizmu, tzw. "molekularnego odcisku palca". Widmo uzyskane dla próbki porównywane jest z referencyjną bazą danych z wykorzystaniem oprogramowania MALDI Biotyper. Technologia umożliwia szybkie sklasyfikowanie nieznanego mikroorganizmu na poziomie rodzaju lub gatunku.

Pojedyncze kolonie bakterii po wstępnej obróbce zgodnie z zalecanym protokołem poddawane były identyfikacji techniką MALDI-TOF. Niewielką ilość próbki nanosiliśmy na płytkę, po czym pokrywaliśmy roztworem matrycy zawierającej kwas α-cyjano- 4-hydroksy-cynamonowy (HCCA), który ułatwia jonizację analitów. Po wysuszeniu, płytkę z nakropionymi próbkami umieszcza się w komorze analizatora, gdzie pod wpływem działania lasera dochodzi do desorpcji i jonizacji cząsteczek matrycy i białek bakteryjnych. Uzyskane widma analizowaliśmy w programie MALDI Biotyper uzyskując raport zawierający informacje o wykrytych bakteriach chorobotwórczych i prawdopodobieństwa poprawności ich identyfikacji. Etap ten jest niezbędny do potwierdzenia wstępnej identyfikacji mikroorganizmów po posiewie na podłożach chromogennych i czystości zebranych kolonii.

W realizację tego zadania zaangażowała się jedna członkini Koła, która miała możliwość przeprowadzić analizy z wykorzystaniem aparatury dostępnej w Katedrze Chemii pod nadzorem dr Ilony Sadok.

Dzięki dotychczasowym pracom już wiemy jakie bakterie występowały na badanych przez nas placach zabaw i na jakich elementach wyposażenia były znajdowane. Wkrótce przystąpimy do kolejnego etapu projektu jakim jest badanie lekooporności zidentyfikowanych bakterii.

Podjęliśmy się również identyfikacji bakterii w bioareozolu pobranym z placów zabaw. Próbki były pobierane za pomocą przenośnego pobornika powietrza przez 10 min. Urządzenie ustawiane było na wysokości 80-100 cm (odpowiadającej wysokości 3-letniego dziecka). Przykładowe wyniki uzyskane dla próbek z 25 placów zabaw zamieściliśmy na poniższym rysunku.

Etap 6. Testy wrażliwości na środki przeciwdrobnoustrojowe wybranych szczepów bakterii z placów zabaw

Spośród zdeponowanych szczepów bakterii z próbek środowiskowych postanowiliśmy ocenić wrażliwość na środki przeciwdrobnoustrojowe bakterii należących m.in. do rodzaju Escherichia, Klebsiella, Enterococcus i Staphylococcus. Nie potwierdziliśmy obecności bakterii należących do pałeczek Salmonella spp., pałeczek Pseudomonas aeruginosa i laseczek Clostridium difficile w zebranym materiale z placów zabaw. Niewrażliwych na wankomycynę enterokoków (VRE) oraz opornych na metycylinę szczepów gronkowca złocistego (MRSA) poszukiwaliśmy poprzez posiewy na specjalnych podłożach mikrobiologicznych wzbogacanych konkretnym antybiotykiem. W przypadku szczepów Escherichia coli oraz Klebsiella spp., testy wrażliwości na antybiotyki lub inne środki przeciwdrobnoustrojowe oceniliśmy metodą dyfuzyjno-krążkową. Do badań wytypowaliśmy szczepy zidentyfikowane z wysokim prawdopodobieństwem z wykorzystaniem techniki MALDI-TOF MS i zdeponowane w laboratorium.

Krążki nasączone wybranym lekiem układaliśmy na płytkę z podłożem Mueller-Hinton’a pokrytą inokulum o gęstości 0,5 w skali McFarlanda, uzyskanym poprzez zawieszenie kolonii danego szczepu w soli fizjologicznej. Średnice stref zahamowania wzrostu bakterii odczytywaliśmy następnego dnia bazując na wartościach granicznych zaczerpniętych z poradnika CLSI (Clinical and Laboratory Standards Institute).

Testowaliśmy antybiotyki i chemioterapeutyki zaliczane do różnych grup leków, między innymi chloramfenikole, antybiotyki β-laktamowe, amino glikozydy, chemioterapeutyki z grupy chinolonów II generacji (fluorochinolony), tetracykliny, sulfonamidy.

Testy wrażliwości bakterii na wybrane środki przeciwdrobnoustrojowe prowadzone były przez zespół składający się z 3 członków Koła pod opieką merytoryczną dr. hab. Rafała Łopuckiego i dr Ilony Sadok korzystając z zaplecza laboratoryjnego Katedry Biomedycyny i Badań Środowiskowych.

Etap 7. Mapa występowania lekoopornych szczepów bakterii na placach zabaw w Lublinie – przygotowanie aplikacji webowej

Przystąpiliśmy do opracowania innowacyjnego narzędzia integrującego środowisko naukowe i społeczeństwo w wymianie informacji na temat lekoopornych patogenów na placach zabaw. Stworzyliśmy aplikację webową umożliwiającą monitorowanie bezpieczeństwa mikrobiologicznego w oparciu o interaktywną mapę Google. Aplikacja pozwala na zarządzanie danymi słownikowymi, informacjami o placach oraz szczegółami dotyczącymi próbek środowiskowych. Dzięki łatwemu dostępowi do informacji, rodzice i opiekunowie mogą świadomie wybierać miejsca zabaw dla dzieci, zwiększając zaangażowanie społeczeństwa w kwestie ochrony zdrowia publicznego.

W ramach projektu zdefiniowaliśmy wymagania funkcjonalne dedykowanego oprogramowania, takie jak:

• możliwość wprowadzania, przechowywania i edycji danych słownikowych („antybiotyki”, „bakterie”, „dostępne atrakcje”, „materiały”);
• możliwość wprowadzania, przechowywania i edycji informacji o placach zabaw (nazwa, opis, współrzędne GPS);
• możliwość wprowadzania, przechowywania i edycji danych dotyczących zebranych próbek;
• wizualizacja lokalizacji placów zabaw z wykorzystaniem interaktywnej mapy;
• panel administratora – możliwość wprowadzania oraz edycji danych powinna być dostępna jedynie dla zalogowanego użytkownika.

Zależało nam również by „mapa” posiadała intuicyjny interfejs, a sama aplikacja działała na popularnych przeglądarkach.

Do bazy danych utworzonej aplikacji zostaną wprowadzone dane uzyskane w toku badań mikrobiologicznych i analizy MALDI-TOF MS. Z mapy będzie można pozyskać informacje dotyczące występowania bakterii, takich jak: Escherichia coli, Klebsiella pneumoniae, Staphylococcus aureus, Pseudomonas aeruginosa, Enterococcus faecium, Salmonella spp. oraz ich wrażliwości na wybrane środki przeciwdrobnoustrojowe.

DZIAŁANIA PROMUJĄCE WYNIKI PROJEKTU:

Udział w konferencjach i organizacja warsztatów

O projekcie w mediach i Internecie

EFEKTY PROJEKTU

Wykaz wystąpień konferencyjnych:

1. K. Kagan, I. Sadok, R. Łopucki, Aktualne problemy i stan wiedzy na temat bezpieczeństwa mikrobiologicznego na miejskich placach zabaw, Ogólnopolski Kongres Nauk Ścisłych i Przyrodniczych (online), 22.07.2023 r., online (referat)
2. M. Hapon, K. Mikulska, A. Niziołek, W. Tomala-Mazur, A. Gruchoła, D. Oleksiak, K. Kagan, A. Bilokinna, M. Skowronek, R. Łopucki, I. Sadok, Antybiotykooporność bakterii: globalne wyzwanie - lokalne działanie, Ogólnopolski Kongres Nauk Ścisłych i Przyrodniczych (online), 22.07.2023 r., online (referat)
3. K. Mikulska, I. Sadok, R. Łopucki, Środowiskowe źródła antybiotykooporności bakterii, I Ogólnopolska Konferencja "Biotechnology - new perspectives for a better future", 9.09. 2023 r., online (referat)
4. A. Bilokinna, I. Sadok, R. Łopucki, Zastosowanie techniki MALDI-TOF w badaniach bezpieczeństwa mikrobiologicznego na miejskich placach zabaw, Konferencja Biopotencjał 2023, 23.11.2023 r., Warszawa (referat).
5. A. Niziołek, A. Bilokinna, M. Skowronek, R. Łopucki, I. Sadok, Ocena częstości występowania bakterii z rodzaju Salmonella na miejskich placach zabaw w aspekcie zagrożeń zdrowia publicznego, XVI Interdyscyplinarna Konferencja Naukowa Tygiel 2024 - “Interdyscyplinarność kluczem do rozwoju”, 21-24.III.2024 r., Lublin (referat)
6. A. Bilokinna, A. Niziołek, M. Skowronek, I. Sadok, R. Łopucki, Analiza mikrobiologiczna miejskich placów zabaw: identyfikacja i charakterystyka Pseudomonas spp., XVI Interdyscyplinarna Konferencja Naukowa Tygiel 2024 - “Interdyscyplinarność kluczem do rozwoju”, 21-24.III.2024 r., Lublin (referat)
7. S. Strawa, D. Oleksiak, I. Sadok, M. Skowronek, R. Łopucki, “Identification of bacteria isolated from bioaerosols collected from public playgrounds in Lublin”, National Scientific Conference „e-Factory of Science” – XI edition, 6.IV.2024 r., online (poster)

8. A. Niziołek, M. Skowronek, R. Łopucki, I. Sadok, “Quantitative analysis of bacteria present on the surface of slides at public playgrounds”, V Międzynarodowe Sympozjum Studenckich Kół Naukowych, 18 kwietnia 2024 r., Lublin.

9. Sz. Strawa, D. Oleksiak, R. Łopucki, M. Skowronek, I. Sadok, “Microbiological assessment of air quality in urban playgrounds: Analysis of aerosol bacteria”, V Międzynarodowe Sympozjum Studenckich Kół Naukowych, 18 kwietnia 2024 r., Lublin.

10. A. Bilokinna, A. Niziołek, I. Sadok, R. Łopucki, M. Skowronek, “Occurrence of Staphylococcus aureus in playgrounds in Lublin”. 3rd International PhD Students’ Conference: Environment-Plant-Animal-Product, 24 kwietnia 2024 r., Lublin

11.  A. Niziołek, A. Bilokinna, Sz. Strawa, I. Sadok, R. Łopucki, M. Skowronek, “Presence of multidrug-resistant Escherichia coli strains in playgrounds in Lublin”. 3rd International PhD Students’ Conference: Environment-Plant-Animal-Product, 24 kwietnia 2024 r., Lublin

Materiały edukacyjne do pobrania

Zestaw 1 Zestaw 2 Zestaw 3 Zestaw 4 Zestaw 5 Zestaw 6 Zestaw 7
Poster konferencyjny o projekcie
Poster konferencyjny dotyczący analizy bioaerozolu
Testowanie lekooporności bakterii   Zestaw 8 Zestaw 9